Chỉnh sửa base (ba-zơ) là một kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen tương đối mới có thể tráo đổi một cặp base DNA cho nhau, cung cấp cho các nhà nghiên cứu một tiền năng để sửa chữa các đột biến đơn nucleotide nguy hại trong hệ gen người. Nhưng các nhóm công cụ chỉnh sửa base hiện nay chỉ cho phép sự chuyển từ C-G thành cặp T-A, làm cho một tỷ lệ đáng kể các đột biến không thể được nhắm đích bằng cách tiếp cận này.
Hiện tại, các nhà nghiên cứu tại Đại học Harvard đã thiết kế một nhóm các protein chỉnh sửa Adenine (adenine base editors (ABEs)) có thể chuyển một cách hiệu quả A-T thành G-C, tạo điều kiện cho phần lớn các đột biến điểm gây bệnh cho quá trình chỉnh sửa. Nhóm nghiên cứu đã báo cáo về phát hiện này vào hôm 25 tháng 10 (2017) trên tạp chí Nature.
“Đó thực sự là một nghiên cứu đầy tinh tế,” theo lời Andrew Bassett, dẫn đầu nghiên cứu về các hoạt động tế bào tại Wellcome Trust Sanger Institute, người mà không liên quan đến công trình này. “Có khả năng phát triển kỹ thuật chỉnh sửa base này cho các loại khác là một việc thực sự khá quan trọng.”
Kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen hiện nay bằng CRISPR-Cas9 tạo ra một đứt gãy mạch đôi trên DNA để tạo ra một sự chèn hoặc xóa đoạn tại vị trí đích. Nhưng tạo ra đứt gãy có thể dẫn đến một số lượng các lỗi kéo theo tại chính vị trí đích, như là chèn hoặc xóa ngẫu nhiên một số nucleotides (gọi là đột biến InDels).
Trái lại, chỉnh sửa base trực tiếp chuyển một cặp base của DNA thành một cặp khác mà không cắt đứt phân tử axit nucleic. Kỹ thuật này, lần đầu được phát triển bởi nhà hóa sinh học David Liu và cộng sự tại Đại học Harvard, gây ra ít đột biến indels hơn và có hiệu quả chỉnh sửa cao hơn.
David R. Liu, giáo sư hóa sinh tại Đại học Harvard, sinh năm 1973
Công cụ chỉnh sửa này bao gồm một enzyme chỉnh sửa base, thuộc về một phiên bản được cải biến đặc biệt của endonuclease Cas9, không có hoạt tính cắt. Sau khi chuyển đổi một base trên một mạch DNA, protein cas9 này tạo ra một dấu vết được gọi là “nick” (một vết cắt nhỏ) trên mạch DNA đối diện (chưa được sửa chữa), thúc đẩy bộ máy sửa chữa DNA của tế bào nhằm thay thế nucleotide nguyên bản vốn đang ở trong trình trạng không khớp với nucleotide mới và vì thế hoàn thành sự tráo đổi một cặp base.
Cre: cen.acs.org/ Adapted from Nature
Nhưng enzyme chuyển dạng base của bộ máy này, tức cytidine deaminase, chỉ có thể chuyển C (cytosine – nhiều tài liệu tiếng Việt ký hiệu là X) thành U (uracil). Không có protein tương tác DNA nào có thể chuyển A thành G.
Sự khử amin hóa chuyển C thành U
Tự nhiên cung cấp cho chúng ta các enzyme cytosine deaminase có thể tác động DNA,” Liu trả lời tạp chí The Scientist. “Thách thức lớn nhất trong việc phát triển một ABE là đang không xác định nhu cầu – điều này rõ ràng khi bạn nhìn vào một sự phong phú một cách bất cân đối về các đột biến trên người mà có thể được chính sửa bằng ABE – mà thực tế là tự nhiên không cung cấp một enzyme khử amin của Adenine.”
Làm sao để thiết kế một enzyme chỉnh sửa Adenine
Tuy nhiên, có một số enzyme khử amin hóa hoạt động trên RNA. Một trong đó là enzyme adenine deaminase trong E.coli được gọi là TadA, chuyển A thành I (inosine) – một base tương đương với G về mặt chức năng – trên phân tử RNA vận chuyển (tRNA). Các nỗ lực trước đó trong phòng thí nghiệm của Liu và các phòng khác để gắn enzyme này vào Cas9 nhằm thu được khả năng chuyển dạng base trên DNA vẫn chưa thành công, Liu cho biết.
Vì thế, đối với đề tài mới nhất của họ, Liu và nhà nghiên cứu liên kết của Harvard, Nicole Gaudelli đã quyết định tạo ra phiên bản TadA chỉnh sửa DNA của chính mình, thông qua một sự kết hợp của tiến hóa có định hướng và thiết kế protein trên E.coli.CRISPR
Đầu tiên, các nhà nghiên cứu cung cấp cho hệ gen vi khuẩn này một phiên bản bất thường tùy chỉnh của một gen kháng kháng sinh. “Chúng tôi đã cài vào các đột biến và nó đòi hỏi một sự khử amin hóa trên DNA để khôi phục tính kháng kháng sinh,” Liu giải thích. Các vi khuẩn này có thể chết khi xử lý với kháng sinh chloramphenicol – trừ khi chúng bằng cách nào đó chuyển được A thành I.
Để thiết kế khả năng chuyển đổi A thành I này, nhóm nghiên cứu sau đó đã tạo ra một thư viện của TadA-Cas9 dung hợp chứa các đột biến trong phần adenine deaminase của bộ máy. “Chúng tôi đã tạo cho mỗi tế bào E.coli một thể đột biến nhất định của TadA,” Liu nói. “Nicole đã tạo ra hàng tỉ biến dị trong mỗi thế hệ vi khuẩn mang đột biến TadA, và sau đó chọn lọc khả năng tồn tại của chúng trong sự có mặt của kháng sinh nồng độ tăng dần.”
Gây tiến hóa có định hướng và thiết kế protein trên vi khuẩn nhằm chọn lọc enzyme chỉnh sửa A-T thành G-C
Vi khuẩn được tạo ra qua thử thách này – tức là, những vi khuẩn nào đã chỉnh sửa được khuyết điểm trong gen kháng kháng sinh của nó – phải chứa thể đột biến TadA có thể hoạt động trên DNA, Liu và cộng sự trình bày. Đủ chắc chắn thì khi các nhà nghiên cứu biểu hiện các phiên bản của các thể đột biến TadA-Cas9 từ những vi khuẩn sống sót trên tế bào người, chúng có khả năng chuyển A-T thành G-C trên DNA – mặc dù hiệu suất là rất thấp (chỉ khoảng 3 phần trăm các tế bào được giải trình tự là thấy có thay đổi).
Trong các vòng khảo sát tiếp theo, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hệ thống vi khuẩn của họ để cải thiện hiệu suất của ABE, và đảm bảo rằng các base có thể được chỉnh sửa trong nhiều hoàn cảnh – ví dụ, nu đứng trước là một A, T, C hoặc G (tương đương với tính đặc hiệu cao hơn). Đến vòng thứ 7, Liu và cộng sự đã chọn được một ABE có thể chuyển A thành I với sai sót tối thiểu, hiệu suất là trên 50 phần trăm – một con số tương đương với enzyme chỉnh sửa G-C thành T-A hiện nay.
“Đó là một nỗ lực rất lớn để làm điều này,” Bassett nói, bổ sung rằng nghiên cứu này là một ví dụ ấn tượng về cách các protein có thể được “uốn nắn” trong tiến hóa có định hướng. “Họ đang cố gắng để có được cái gì đó thực tế hoạt động tốt một cách không tưởng. Đây đúng là một bước tiến lớn trên khía cạnh mở rộng toàn bộ lĩnh vực chỉnh sửa base.”
Các tiềm năng trị liệu của kỹ thuật chỉnh sửa base
Để xác định tiềm năng trị liệu của nó, nhóm đã chỉnh sửa một đột biến điểm có liên quan đến một bất thường trong khả năng hấp thu sắt có thể gây hại được gọi là bệnh nhiễm sắc tố sắt mô di truyền (hemochromatosis). Nucleotide A đột biến được thay thế với hiệu suất gần 30 phần trăm trên dòng tế bào người, mà không phát hiện ra indels mới nào phát sinh thêm.
Nhà kỹ thuật sinh học Feng Zhang tại Viện mở của MIT nhấn mạnh trong một email rằng nhóm nghiên cứu đã sử dụng “một cách tiếp cận toàn diện và sáng tạo” để đạt được độ chính xác tương tự. “chúng tôi đang tìm kiếm cách để viết lại chính xác các đoạn mã di truyền”, Feng viết, người mà sở hữu phương pháp chỉnh sửa base trên RNA dựa trên CRISPR đã được công bố cùng ngày (25/10) trên tạp chí Science. “Các enzyme chỉnh sửa base đưa chúng tôi đến gần với đích này hơn.”
Tất nhiên, công nghệ mới không hoàn thành được tất cả – nó vẫn không thể chuyển G thành C, hay A thành T chẳng hạn. Nhóm của Liu đang nỗ lực để phát triển các nhóm enzyme chỉnh sửa base khác để thực hiện các thay đổi base nói trên.
“Chúng tôi đang cố gắng phát triển các dạng mới của ABE, tối đa hóa khả năng nhắm đích cũng như tính hữu dụng của nó,” Liu nói. “Và chúng tôi tất nhiên cũng sử dụng kỹ thuật chỉnh sửa của mình, trong sự hợp tác với các chuyên gia sinh lý bệnh, để sửa chữa thử nghiệm trên mô hình động vật các bệnh di truyền của người.”
Xem bài báo gốc: Gaudelli et al., “Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage,” Nature, doi:10.1038/nature24644, 2017.
Nguồn bài viết: Base Editing Now Able to Convert Adenine-Thymine to Guanine-Cytosine
